Значение микроскопического и микробиологического методов исследования пиогенных кокков для диагностики гнойно-септических заболеваний

/Clostridiumspp.; Mobiluncusspp./Corynebacteriumspp.; Peptostreptococcusspp. - аэробный дисбиоз, если дисбаланс, вызван аэробной микрофлорой:Enterobacteraceae, Streptococcusspp. и Staphylococcusspp.- смешанный дисбиоз, если дисбаланс, вызван любым сочетанием аэробной, анаэробной флоры и грибами родаCandida[2].ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГЛАВА 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КОККОВОЙ МИКРОФЛОРЫ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАГИНОЗАХ3.1 Материалы и методы исследованийИсследование проводилось на базе бактериологической лаборатории ГКБ №5 г. Нижнего Новгорода. Клинический материал (мазки из влагалища) был получен от пациенток с предварительным диагнозом бактериальный вагиноз из гинекологического отделения ГКБ №5 г. Нижнего Новгорода.Исследования микрофлоры урогенитального тракта женщин проводили в соответствии с приказомМЗ СССР №535 [8].Исследуемый материал, взятый тампоном, засевали, используя штриховую технику посева, на половину чашки Петри скровяным агаром, затем производили посев тампоном в сахарный бульон.Посевы инкубировали при температуре 37°С. При появлении роста на плотных средах проводили подсчетколоний различной морфологии, учитывая их соотношение.При помутнении бульона делали мазки на стекле и окрашивали их по Граму. В соответствии с результатами микроскопии из бульонных накопительных культур и колоний, выросших на плотных питательных средах,производили дальнейшие высевы на соответствующиеплотные питательные средыдля видовой идентификации выделенных культур микроорганизмов.Для выделения стафилококковиспользовали молочно-желточно-солевой агар. Посевы помещали втермостат на 370С. Через 24 ч для дальнейшего изучения отбирали округлые, маслянистые, выпуклые пигментированные колонии, клетки которых при микроскопии после окрашивания по Граму имели вид грамположительных кокков в скоплениях типа «виноградная гроздь». Кроме того, у выросших колоний, отмечали наличие лецитовителлазы. На следующем этапе работы для видовой идентификации стафилококков дополнительно ставили еще 3 биохимических теста – способность к анаэробному сбраживанию маннита, способность к образованию плазмакоагулазы и чувствительность к новобиоцину. Выделенные штаммы идентифицировали как S. aureus, если они сбраживали маннит в анаэробных условиях и синтезировалиплазмокоагулазу. Выделенные штаммы идентифицировали какS. epidermides, если они не были способными к анаэробному сбраживанию маннита и не синтезировали плазмокоагулазу. Тест чувствительности к новобиоцину был положительным уS. aureusи S. epidermidis и отрицательным уS. saprophyticus[8].Идентификацию стрептококков, которые в мазках имели вид кокков в цепочках и окрашивались по Граму положительно, начинали с исследования колоний в первичных посевах патологического материала на чашках с 5% кровяным агаром (прил. А, Б). По виду гемолиза они были разделены на β- (полный гемолиз) и α-(неполный гемолиз) гемолитические стрептококки. Для β-гемолитических стрептококков с целью установления их видовой принадлежности ставили реакцию преципитации на стекле для определения серогруппы (А, В, С). Если происходила преципитация культур с соответствующей сывороткой, которая содержит антитела к антигенам стрептококков группы А, то штамм относили к S. pyogenes, В –S. agalactiae, C –S. equisimilis. Для выделения энтерококков(Enterococcus sp.) – в мазках положительных по Граму диплококков – использовали Enterococcus agar (Serva). В эту среду входил трифенилтетразолия хлорид (ТТХ), который, расщепляясь энтерококками, придавал их колониям характерную малиновую окраску [8] (прил. А, Б). 3.2Результаты и их обсуждениеВ результате проведенного исследованияклинического материала от 115 женщин репродуктивного возраста с неспецифическими бактериальными вагинозами и вагинитами, вызванные условно-патогенной аэробной и факультативно-анаэробной микрофлорой было выделено 296 штаммовУПМ, развитие которых вызвало возникновение воспалительных заболеваний урогенитального тракта и привело к появлению его дисбиотических нарушений. Было установлено, что в данных условиях проведения эксперимента, при использовании микроскопической и микробиологической техники исследования, наиболее важная роль в развитии дисбиотических нарушений УГТ женщин принадлежит бактериям родаStaphylococcus(табл. 3.1).Таблица 3.1Частота выделения условно-патогенной микрофлоры изурогенитального тракта у женщин при дисбиотических нарушенияхГруппа микроорганизмовАбсолютное количество штаммов% от количества всех выделенных культурStaphylococcus sp.10836,5Streptococcus sp.3511,8Enterococcus sp.5117,2Enterobacteriaceae7324,7Candida sp.299,8Всего296100Всего было выделено 108 штаммов родаStaphylococcus, что от общего количества микроорганизмов составляло 36,5%. Второе место по частоте встречаемости принадлежало бактериям семействаEnterobacteriaceae. Эти представители условно-патогенной микрофлоры выделялись в 24,7% случаев. Бактерии родаEnterococcusзанимали третью позицию по частоте высеваемости. Их процент от общего количества выделенных штаммов составил 17,2%. Наименьшее количество культур (11,8 и 9,8%) было представлено соответственно грамположительными коккамиStreptococcus sp.и грибами родаCandida.Идентификацию выделенных кокковых форм бактерий, как указывалось ранее, проводили путем изучения их морфологии с использованием бактериоскопического, а физиолого-биохимических признаков – с помощью бактериологического методов исследования.При микроскопии,окрашенные по Граму, стафилококки имели вид фиолетовых кокков, которые располагались в виде виноградных гроздей (прил. А). Далее у выделенных штаммов стафилококков проверяли наличие плазмокоагулирующей и гемолитической активностей, а также способности к ферментации маннита в анаэробных условиях и устойчивость к новобиоцину.В результате работы установлено, что выделенные бактерии рода Staphylococcus были представлены 3 видами –S. аureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.Все выделенные культуры на МЖСА образовывали непрозрачные, выпуклые колонии с гладкой, блестящей поверхностью, маслянистой консистенции.На МЖСА 24 штаммаS. аureus, выделенные из биоматериала, образовывали колонии с зоной помутнения вокруг них, что свидетельствовало о наличии лецитиназной активности. Все выделенные культуры золотистого стафилококка были способными к анаэробной ферментации маннита и синтезу плазмокоагулазы. 31 из них – образовывали зоны гемолиза на кровяном агаре, 38– характеризовались наличием золотистого пигмента (прил. Б, В; табл. 3.2).Из 37 штаммов S. epidermidis, 23 характеризовались наличием лецитиназной и 27 – гемолитической активностей.26 штаммов из 108 исследованных культур были отнесены к S. saprophyticus. Они характеризовались отсутствием главных факторов патогенности, которые были установлены для других стафилококков, кроме лецитиназной активности.Тест на устойчивость к новобиоцину был положительным для всех штаммов S. saprophyticus.Таблица 3.2Видовая принадлежность стафилококков, выделенных из клинического материалаВидФакторы патогенностиS. aureus(45штаммов)S.saprophyticus(26штаммов)S. epidermidis(37штаммов)Наличие желтого пигмента38––Плазмокоагулаза45––Лецитиназа24 1723Анаэробная ферментация маннита45––Гемолиз31–27Устойчивость к новобиоцину–26–Таким образом, видовой состав стафилококков, выделенных от пациенток с бактериальными вагинозами, был представлен в 41,7% случаев S. aureus, в 34,2% –S. epidermidis, в 24,1% – S. saprophyticus (рис. 3.1).Рис. 3.1. Видовой состав стафилококков, виделенных из клинического материала при бактериальных вагинозах24,1%34,2%41,7%Частота выделения,%Штаммы51 штамм, что составило 17,2% от всех выделенных культур, был идентифицирован как Enterococcus sp. Эти культуры в мазках были представлены диплококками. По граму окрашивались положительно.На агаре для культивирования энетерококков образовывали малиновые колонии. При окраске по Граму и микроскопии мазков из выросших колоний 35 культур имели вид грамположительных кокков в цепочках, что позволило отнести данные штаммы к бактериям р. Streptococcus.Образование полного гемолиза вокруг этих колоний на кровяном агаре дало возможность причислить выделенные стрептококки к группе β-гемолитических стрептококков. При постановке реакции преципитации на стекле была проведена окончательная идентификация β-гемолитических стрептококков до вида. 28 культур агглютинировались сывороткой, содержащей антитела к антигенам группы А; 5 – агглютинировались сывороткой, содержащей антитела к антигенам группы В, а 2 – к антигенам группы С. В соответствии с полученными данными 28 штаммов стрептококков были отнесены к виду S.pyogenes, 5 – S. agalactiaeи 2 – S. equisimilis.Полученные нами результаты подтверждают данные ряда исследователей (Н.М. Мамедалиевас соавт.; В. Е. Радзинский с соавт.)о том, что ведущая роль в возникновении бактериальных вагинозов, вызванных развитием УПМ, принадлежит кокковой микрофлоре (стафилококкам), а именно – золотистому стафилококку [3, 7].ВЫВОДЫВ результате проведенного исследования клинического материала от 115 женщин репродуктивного возраста с неспецифическими бактериальными вагинозами и вагинитами, вызванные условно-патогенной аэробной и факультативно-анаэробной микрофлорой, выделено 296 штаммов УПМ, развитие которых вызвало возникновение воспалительных заболеваний урогенитального тракта и привело к появлению его дисбиотических нарушений. Весь спектр выделенных микроорганизмов был представлен кокками родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, палочковидными бактериями семейства Enterobacteriaceaeи грибами рода Сandida.Показано, что ведущая роль в возникновении бактериальных вагинозов, вызванных развитием УПМ, принадлежит кокковой микрофлоре, которая выделялась в 65,5% случаев, а именно стафилококкам. Частота высеваемости их при бактериальных вагинозах составила 36,5% от общего числа выделенной УПМ.Установлено, что видовой состав стафилококков, выделенных от пациенток с бактериальными вагинозами, был представлен в 24,1%– S. saprophyticus, в 34,2% – S. epidermidis, и в 41,7% случаев S. aureus, что доказывает этиологическую роль последнего в развитии дисбиотических нарушений УГТ женщин.СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫБорисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. / Л. Б. Борисов. – М.: Медицина. – 2002. – 306 с.Дисбактериозы – актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко, Б.А. Шендеров // Вестн. РАМН. – 2007. – №11. – С.12-18.Мамедалиева Н. М. Современные аспекты лечения вагинальных инфекций / Н. М. Мамедалиева, Ф. Н. Тлеубердиева // Здоровье Казахстана. – 2015. – Т. 43, №12. – С. 43-48.Медицинская микробиология / под ред. О. К. Поздеева, В. И.Покровского. – М.: ГЭОТАР-МЕД.– 2001. – 656 с.Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / под ред. А. И. Коротяева, С. А. Бабичева. – С-П.: Спецлит.– 2008. – 768 с.Назарова Е. К. Микробиоценоз влагалища и его нарушения / Е. К. Назарова, Е. А. Гиммельфарб, Л. Г. Созаева // Клинич. лаборат. диагн. – 2003. – №2. – С.25-32. Особенности действия препарата «Бетадин» при восстановлении биоценоза влагалища / В. Е. Радзинский, М. И. Пиддубный, Т. В. Багаева, А. Г. Кочетов, З. Л. Гончаревская //Consilium Medicum «Гинекология. Журнал для практикующих врачей». – 2003. – Т.5, № 5. – С.18-23. Приказ Минздрава СССР ОТ 22.04.85 N 535. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.Сидорова И.С. Микрофлора половых путей у женщин репродуктивного возраста / И.С. Сидорова, Е.И. Боровкова. – М.: Практическая медицина, 2007. – 80 с.Цизина Е. А. Нормоценоз влагалища и его влияние на здоровье женщин / Е. А. Цизина, Н. А. Ильина // Молодой ученый. – 2011. – Т.2, №8. – С. 152-156.Бактериальный вагиноз: пособие для врачей / Л. В. Кудрявцева, Е. Н. Ильина, В. М. Говорун и др. // Источник: http://www.lytech.ru/data/file/bak-vaginoz.pdfЕвсеев А. А. Вагинальный дисбиоз и методы его коррекции / А. А. Евсеев // Источник: http://www.mediasphera.ru/uppic/Akusherstvo/2007/4/15/AKU_2007_04_15.pdfРоль стафилококков в развитии бактериального вагиноза и инфекционных процессов репродуктивной системы женщин / Т.Н. Ротай, А. И. Винников, О.С. Воронкова, В. В. Мысик // Источник:http://www.rusnauka.com/7_NITSB_2014/Biologia/6_161037.doc.htmПРИЛОЖЕНИЯПриложение АМорфологические особенности пиогенных кокков при бактериоскопии.Форма и расположение клеток Staphylococcussp.(а), Streptococcussp.(б),Enterococcus sp.(в)а)б)в)Приложение БРост пиогенных кокков на дифференциально-диагностических и элективных питательныхсредах: а) рост S. aureus на МЖСА; б) рост Streptococcussp.на кровяном агаре; в) рост Enterococcus sp. на Enterococcus agar. а)б)в)Приложение ВГлавные факторы патогенности золотистого стафилококка: а)синтез плазмокоагулазы; б) ферментация маннита в анаэробных условиях; в) образование лецитиназы на МЖСА; г) полный гемолиз на кровяном агареконтрольИзменение цвета среды при ферментации маннитаконтрольСгусток плазмы при образовании плазмокоагулазыа)б)в)г)