Свойства и применение красителя Hoechst в биотехнологии

Различные стадии клеточного цикла отличаются по содержанию ДНК в клетке.Проточная цитометрия в иммунологии активно используется для иммунофенотипирования клеток крови, позволяет идентифицировать внутриклеточные белки, оценить степень цитотоксичности, и многое другое.Достаточно быстро проточная цитометрия стала рутинным методом в диагностических лабораториях клиник.На сегодняшний день проточные цитометры, зарегистрированные Росздравнадзором, в лабораторной диагностике активно используют для оценки иммунного статуса пациента (для этого используют такие поверхностные маркеры, как CD3, CD4, CD8, CD 19, CD 20, CD22 и т.д.), оценку иммунологического фенотипа нормальных и опухолевых клеток для своевременной постановки диагноза, а также отслеживание острых лейкозов в ходе лечения. Большой вклад проточная цитометрия внесла в диагностику гемобластозов.Для работы на проточных цитометрах используются как клеточные красители, так и моноклональные антитела для проточной цитометрии для научных, так и клинических приложений. Этот метод применялся для анализа влияния встраивания гистонов на геномные последовательности на примере DrosophilaMelanogaster. В числе используемых красителей также присутствовал Hoerchst. Метод исследования основывался на определении экспрессии гистонов в клетках имагинальных дисков мух посредством проточной цитометрии. При разработке методики выполнения данного эксперимента обнаружилось, что при совместном использовании Херст и спермина, спермидина окрашивание неравномерное и недостаточно яркое. Это происходит из-за конкуренции за связывание ДНК между красителем и стабилизаторами. Полученные результаты говорят о том, что от их совместного использования нужно отказаться. Мезенхимальные стволовые клетки- важный маркер восстановления тканей при таких патологических процессов как воспаление, ангиогенез, опухолевый рост и другие. Ученые из университета Колорадо проводили исследование, целью которого была разработка методики для определения состава легочной ткани и обнаружения мезенхимальных стволовых клеток. Hoechst использовался в качестве красителя для визуализации клеток и дифференцировки сторонней популяции. В результате настоящего эксперимента метод, предназначенный для дифференцировки клеток крови был адаптирован для разделения клеточных популяций. Его использование в дальнейшем может повлиять на разработку терапевтических стратегий для лечения легочных заболеваний. [7]Подобные исследования проводились для выявления сторонней популяции в клеточных линиях раковых клеток. Для этого использовались клетки рака яичника Skov-3 и колоректального рака Colo 320.Также клеточный материал получали у пациентов с мелоаномой. Их очищали, измельчали, сажали на питательную среду, после чего окрашивали Hoerchstи определяли их жизнеспособность. Для анализа поверхностных маркеров проводили иммуноцитохимическое окрашивание клеток, используя моноклональные антитела к поверхностным антигенам: CD34, CD44, CD24, CD133, конъюгированные с одним из флуорохромов: аллофикоцианином (АРС), флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ). Анализ клеточных культурна наличие сторонней популяции выявилприсутствие такой популяциикак в культуре опухолияичника Skov-3, так и в культуре колоректального рака Colo 320. Клетки, входящие в эту популяцию, составилисоответственно 0,2% и 0,6% отобщегоколичества клетокданнойлинии.Анализ клеточной суспензии раковых клеток от больной злокачественной меланомой выявил наличие сторонней популяции, которая составляла 1,3% от общей популяции клеток.[1]Суспензия клеток, полученная из того же опухолевого материала, была исследована на наличие поверхностных молекулярных маркеров CD34 и СD44, характерных для стволовых клеток, включая РСК. Была выявлена минорная клеточная субпопуляция клеток меланомы, экспрессирующая на своей поверхности оба маркера.Также ведутся исследования, оценивающие возможность проточной цитометрии выступать в качестве неинвазивного эквивалента биопсии. Такое исследование проводилось на базе Дальневосточого Государственного медицинского университета и изучало диагностические возможности проточной цитометрии мочи для диагностики рака мочевого пузыря. В качестве красителя использовался Hoerchst. Проточная цитометрия в этом случае показала значимые диагностические результаты и диагноз рак мочевого пузыря и его гистологическая характеристика были подтверждены после выполнения цистоскопии и забора биопсии стандартным методом. Также существуют исследования, оценивающие сравнительную характеристику использования DAPI и Hoerchstдля выполнения проточной цитометрии и оценки фоновой флуоресценции, специфичности красителя и коэффициента вариации для синей флуоресценции природных популяций.Образцы морской воды былисобраны в промытые кислотой поликарбонатные бутылки илистерильные полипропиленовые центрифужные пробиркиниже поверхности моря в заливе Канеохе, Гавайии в 2,5 км от бухты (внешней станции) в течение двух месяцев. Основной экспериментальный дизайн должен был определить оптимальную концентрацию красителя и минимальное окрашиваниевремя для оценки численности бактерий методом проточной цитометрии и досравнить прямые счета EFM с оценками FCM, для которыхэти оптимальные условия были использованы. Для определения оптимальной концентрации красителя H0342 или DAPI были добавлены для разделенияаликвоты по 1,0 мл фиксированной морской воды и их выдерживали в течение 2-5 часовдо анализа.H0342 и DAPI имеют одинаковое возбуждение и излучениемаксимумы и удивительно похожи с точки зрениясвязывания с нуклеиновыми кислотами. Существует, однако, два важных фактора, которые отличают этидва красителя, что делает H0342 лучше подходящим для анализаморских бактерий методом проточной цитометрии. Во-первых, хотя абсолютный квантовый выход флуоресценции комплекса DAPI-AT на 17% выше, чем у комплекса H0342-AT (относительный квантовый выход флуоресценции (квантовый выход флуоресценции относительно несвязанного красителя в растворе) на 30% выше для H0342, чем для DAPI. Более высокий относительный квантовый выход флуоресценции H0342 объясняет, почему клетки, окрашенные этим красителем, лучше отделены от фона флуоресценции растворенногокрасителя. Во-вторых, DAPI-AU комплексы сРНКявляются флуоресцентными, в то время как комплексы H0342-AU не флуоресцентные.[2] Комплексы, образованные между H0342 (также Hoechst33258) и аденозин-бромодезоксиуридиновые пары оснований не флуоресцентные. Ожидается, что флуоресцентные комплексы DAPI-AU вносят измеримый вклад в CV синюю флуоресценцию, потому что от 40 до 60% клеточной РНК находится в двухцепочечнойформе и содержание клеточной РНКморских бактерий изменчиво (в зависимости от условий роста), варьируя от половины до более чем вдвое от содержания ДНК.DAPIможет связываться с клеточной стенкой и внеклеточным материалом, особенно с полифосфатами и РНК, и большая часть этой флуоресценции теряется после обработки РНКазой.Согласно результатам недавних исследований, красители Hoechstспособны влиять на транскрипцию в эукариотической клетке. Были проведены эксперименты на HeLa клетках несущих ретровирусный вектор с эпигенетически инактивированным репортерным геном зеленого флюоресцентного белка GFP, показано реактивирующее действие на этот ген со стороны красителей, связывающихся с ДНК ,в том числе Hoechst 33342, Hoechst 33258. При этом Hoechst 33258 вызывал снижение метилирования ДНК в промоторной области трансгена GFP, а Hoechst 33342 – модификации H3K4me3.Свойства связывания красителей Hoerchst с фибриллой амилоидного бета (Aβ) были тщательно изучены в экспериментах insilico и invitro. Hoechst 34580 и Hoechst 33342 предпочитают располагаться вблизи гидрофобных областей с аффинностью связывания, в основном определяемой взаимодействием Ван-дер-Ваальса. С помощью анализа тиофлавина Т было установлено, что константа ингибирования IC50 ≈ 0,86 и 0,68 мкМ для Hoechst 34580 и Hoechst 33342 соответственно. Этот результат качественно согласуется с оценкой свободной энергии связи с использованием метода молекулярной механики-Пуассона-Больцмана и моделирования всех атомов с помощью силового поля AMBER-f99SB-ILDN и модели воды TIP3P. Кроме того, ДНК-красители обладают высокой способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер. Таким образом, как invitro, так и invitro эксперименты показали, что Hoechst 34580 и 33342 являются хорошими кандидатами для лечения болезни Альцгеймера путем ингибирования образования Aβ.[13]Симметричныебисбензимидазолы являются первыми селективными ингибиторами единственного хорошо охарактеризованного DfrB, DfrB1, встречаются в плазмидах с множественной резистентностью, потенциально ускоряя их распространение и мутантные варианты приводят к формированию множественной резистентности у микроорганизмов. Концевые карбоксилаты и длина молекулы бисбензимидазолов позволяют установить необходимые взаимодействия с DfrB1.Две кристаллические структуры демонстрируют одновременное связывание двух молекул ингибитора в симметричном активном центре. Наблюдения за этими димерными ингибиторами вдохновили на создание мономерных аналогов, связывающих в единственном экземпляре, но обладающих аналогичной эффективностью ингибирования. Ингибирование второго члена семейства DfrB, DfrB4, указывает на общность этих ингибиторов. Эти результаты дают ключевое представление о ингибировании DfrB с высокой устойчивостью к TMP, открывая возможности для последующей разработки антибиотиков для борьбы с этим новым источником устойчивости.[14]ЗаключениеСпецифичность красителей Hoechstобусловлена их химическими свойствами: энергетически более выгодное связывание с О2 атомом тимина и N3 аденина, связь стабилизируется за счет электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. При изучении данных о сравнительных характеристиках применения этих красителей и других, аналогичных им по механизму действия, не было получено однозначного ответа о предпочтительном использовании одних или других, при выполнении ряда методик более качественное изображение получалось при использовании Hoechst,для других методик лучший сигнал получался при использовании DAPI. Этот вопрос требует дальнейшего изучения.Также помимо прямой функции Hoechst, то есть его использования как красителя, интерес представляют также его побочные свойства, как например влияние на экспрессию генов, цитостатическое действие и влияние на синтез бета-амилоида, то есть применение в лечении болезни Альцгеймера. Список литературы12 методов в картинках: проточная цитофлуориметрия, Биомолекула- https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-v-kartinkakh-protochnaia-tsitofluorimetriiaГромыко А.В., Синтез и цитологические исследования димерных молекул Херст 33258,Биоорганическая химия, 2005, том 31, с.358-393Гроховский С.Л., Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. Биоорганическая химия, 2002, том 28, №6,с. 502-517Соколовская А. А., Заботина Т. Н., Московцев А. А., Лукашина М. И., Жданов Р. И., Блохин Д. Ю. Характеристика методов регистрации апоптоза и их использование в экспериментальной и клинической онкологии // Российский биотерапевтический журнал. 2003. №3. Хайдуков Сергей Валерьевич, Зурочка А. В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине // Медицинская иммунология. 2007. №4-5Belloc V., A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells. Cytometry, 1994, v.17Chow, K. S., Jun, D., Helm, K. M., Wagner, D. H., Majka, S. M. Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (56), e3159, doi:10.3791/3159 (2011).Cold Spring Harb Protocols. Analyzing Cell Death by Nuclear Staining with Hoechst 33342. 2016 Cold Spring Harbor Laboratory PressKaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc 1, 2406–2415 (2006) doi:10.1038/nprot.2006.356Lukinavičius, G., Blaukopf, C., Pershagen, E. et al. SiR–Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nat Commun 6, 8497 (2015) doi:10.1038/ncomms9497Monger B. Flow Cytometric Analysis of Marine Bacteria withHoechst 3334. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 1993, P. 905-9Szbao G. Flow Cytometric Analysis of the Uptake ofHoechst 33342 Dye by Human Lymphocytes'. CYTOMETRY. Vol. 2, No. 1. 1981Thai NQ, Tseng NH, Vu MT, et al. Discovery of DNA dyes Hoechst 34580 and 33342 as good candidates for inhibiting amyloid beta formation: in silico and in vitro study. J Comput Aided Mol Des. 2016;30(8):639–650. doi:10.1007/s10822-016-9932-1Toulouse JL, Yachnin BJ, Ruediger EH, et al. Structure-Based Design of Dimeric Bisbenzimidazole Inhibitors to an Emergent Trimethoprim-Resistant Type II Dihydrofolate Reductase Guides the Design of Monomeric Analogues. ACS Omega. 2019;4(6):10056–10069. Published 2019 Jun 10. doi:10.1021/acsomega.9b00640Xie, F., Timme, K.A. & Wood, J.R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Sci Rep 8, 7930 (2018)Yasekuda Y., Nucleus-selective Chemical Proteomics Using Hoechst-tagged Reactive Molecule., Chemistry letters, Volume 45, Issue 3