Эпигеномные технологии в диагностике вирусных инфекций

Для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS авторы провели ряд экспериментов и показано, что комплексы, сформированные на основе AsCpf1 из Acidaminococcusи LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять до 1 фг ДНК ВИЧ-1 (что соответствует65 копиям ДНК, внесённым в реакцию предварительной амплификации) на30-м цикле (30 мин.) анализа.Рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS способны обнаруживать до 10 фг ДНК ВИЧ-1 (что соответствует650 копиям ДНК, внесённым в реакцию предварительной амплификации) при25ºС и 42ºС. Оптимальной температурой для проведения анализа является37ºС, поскольку рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS способныобнаруживать до 1 фг ДНК ВИЧ-1 и значение сигнала превышает значение«шума» более чем в 2,5 раза[10].Кроме того, было показано, что увеличение количества вносимой в реакцию мишени, как и комбинирование мишеней, вносимых в реакцию, не приводитк существенным изменениям значений флуоресценции в образце с минимальным количеством анализируемого материала (1 фг ДНК ВИЧ-1).Для обнаружения единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS был оптимизирован процесспредварительной амплификации за счёт увеличения количества циклов. В ходепроведённого анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексыCRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии ДНК ВИЧ-1, причем увеличение количества циклов предварительной амплификациидо 35–40 позволяет обнаруживать до 2 аг ДНК ВИЧ-1 (2 × 10–18 г, что соответствует 1,3 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). При этом уже на 10-15-м цикле (10–15 мин.) анализа значение сигналапревышало значение «шума» вдвое, а к 60-му циклу анализа — более чем в3–10 раз, при внесении в анализ материала, предварительно амплифицированного в течение 35 циклов.Разработаны направляющие РНК, позволяющие выявлять единичные копии провирусной ДНК ВИЧ-1 in vitro в составе рибонуклеопротеиновыхкомплексов CRISPR/CAS, в биологических образцах после предварительнойамплификации[10].ЗАКЛЮЧЕНИЕВ последние два десятилетиябыл достигнут прогресс в выявлении молекулярных механизмов эпигенетического контроля, что оказало значительноевлияние на понимание нормального развития и способов лечения заболеваний человека. Молекулярная диагностика получила новый импульс в своем развитии, накоплен огромный теоретический и практический опыт внедрения молекулярных технологий в различные области медицины, криминалистики и ветеринарии. С появлением технологий высокопроизводительного секвенирования стало возможным проведение метагеномного анализа и получение информации о вирусных сообществах. Полногеномноесеквенирование может стать стандартным подходом для осуществления эпидемиологического надзора за внебольничными и госпитальными инфекциями, мониторирования распространенности и эволюции большинства патогенов.Прогресс в изученииполногеномных последовательностей патогенов, особенностей генов и организации генома, факторов патогенности, систем регуляции транскрипции генов и экспрессии белков позволил открыться новым возможностям для фундаментальной микро биологии, вирусологии и эпидемиологии для созданияинформативных и прецизионных технологий и методов винтересах детальной характеристики возбудителейинфекций [7].СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Акимкин В.Г., Тюменцев А.И., Тюменцева М.А. Система CRISPR-CAS для детекциипровирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях // Патент РФ № 2720768. –2019.–Бюл. № 14.2.Ванюшин Б.Ф. Эпигенетика сегодня и завтра// Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. – №17(4/2). – С. 805-832.3.Гилязова А.В., Зенин П.В., Пронин А.Ю. и др. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в Московской области// Вопр. вирусол. –2010. –№ 5. –С. 25-28.4.Елпаева Е.А., Порецкова Е.А., Писарева М.А. и др. Генотипическая характеристика вируса гепатита Ву хронически инфицированных больных // Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии. –2009. –№ 15. –С. 56-59.5.Иванцов А.О. Патоморфология и молекулярная диагностика: критический взгляд // Практическая онкология. –2018. –Т. 19. № 3. –С. 236-247.6.Киселев О.И. Эндогенные ретровирусы: структура и функции в геноме человека// Вопр. вирусологии. –2013.–№ 1. –С. 102-115.7.Нарвская О.В. Вирус папилломы человека. Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика папилломавирусной инфекции// Инфекция и иммунитет. –2011. –Т. 1. № 1. –С. 15-22.8.Паткин Е.Л., Софронов Г.А. Эпигенетика популяций, экотоксикогенетика и болезни человека // Экологическая генетика. –2012. –Т. 10. № 4. –С. 14-28.9.Соломатина Е.В., Рахманов Р.С., Потехина Н.Н. и др. Молекулярно-генетические методы в организации федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора за парентеральными гепатитами среди лиц опасных профессий// Медицинский альманах. –2012. –Т. 22. № 3. –С. 90-93.10.М.А. Тюменцева, А.И. Тюменцев, В.Г. Акимкин Разработка подходов для детекциипровируснойДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях с применением системы CRISPR/CAS//Всероссийская научно-практическая конференция: Молекулярная диагностика и биобезопасность – 2020. –М.: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 2020. –С. 118-122.11.Энсхсайхан Д., Лопарев В.Н., Bostik V. и др. Генотипирование вирусов варицелла-зостер, выделенных на территории Монголии// Вопр. вирусол. –2010. –№ 5. –С. 40-42.12.Яковлева Л.С. Сенюта Н.Б., Степина В.Н. и др. Вирус Эпштейна-Барр у больных раком носоглотки: варианты гена LMP1, гуморальный ответ и клинические проявления болезни// Вестник РОНЦ им. Н. Н. БлохинаРАМН. –2012. –Т. 23. № 1. –С. 54-61.13.Chen J., Ma E., Harrington L., Da Costa M., Tian X., Palefsky J., Doudna J. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity// Science.– 2018. –Vol. 360. –P. 436–439.14.Joseph S.J., Read T.D. Bacterial population genomics and infectious disease diagnostics// TrendsBiotechnol. –2010. –Vol. 28. № 12.–P. 611-618.15.Kolb A. W., Adams M., Cabot E.L. et al. Multiplex sequencing of seven ocular Herpes simplex virus type -1 genomes: phylogeny, sequence variability, and SNP distribution// IOVS. –2011. –Vol. 52. № 12.–P. 9061-9073.16.Renzette N., Bhattacharjee B., Jensen J.D. et al. Extensive genome-wide variability of human cytomegalovirus in congenitally infected infants// PLoSPathog. –2011. –Vol. 7. № 5.– P. 1-14.17.Szpara M.L., Parsons L., Enquist L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of Herpes simplex virus 1 reveals new mutations // J. Virol. – 2010. –Vol. 84. № 5.–P. 5303–5313.18.van Cuyck H., Pichon B., Leroy P. et al. Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis of Streptococcus pneumoniae and comparison with multiple loci sequence typing// BMC Microbiol. –2012. –Vol. 12. № 241.–P. 1-9.19.Zell R., Taudien S., Pfaff F. et al. Sequencing of 21 varicella-zoster virus genomes reveals two novel genotypes and evidence of recombination // J. Virol.– 2012. –Vol. 86 № 3. –P. 1608-1622.