Генно-инженерные методы получения белков

Это направление появилось совсем недавно. Были разработаны новые методологические подходы, связанныес особенностями молекул РНК, а именно их нестабильностью и быстрой деградацией в организме млекопитающих, необходимостью эффективного способа доставки в клетки для осуществления процесса трансляции, а также с решением проблем, вызванных возникновением мощного провоспалительного ответа при введении РНК. В прошедшем десятилетии последняя из перечисленных проблем была в значительной степени преодолена путем включения в состав вакцинной последовательности РНК модифицированных нуклеозидов, оптимизации последовательности РНК, тщательной очистки от побочных продуктов (в особенности двуцепочечной РНК — дцРНК), что позволило снизить токсичность терапевтической мРНК и увеличить степень ее трансляции в организме [4].Структура РНКвакцин включает открытую рамку считывания, которая кодирует антиген, и фланкирующие ее последовательности: 5′ и 3′нетранслируемые области (UTR) по обе стороны от открытой рамки считывания , 5′концевой 7метилгуанозиновый кэп и 3′полиадениловый хвост (полиА). Эти элементы необходимы для максимизации скорости трансляции и/или персистенции вектора в трансформированных клетках в результате взаимодействий с регуляторными белками, другими РНК и метаболитами [4]. РНКвакцины могут быть как в виде нереплицирующегося вектора, так и в форме самовоспроизводящегося репликона [5]. Конструкция самовоспроизводящихся векторов содержит дополнительные вирусные элементы, ответственные за репликацию [6]. Получают РНКрепликоны путем замены структурных генов одноцепочечныхРНКвирусов (например, альфавирусов, флавивирусов, пикорнавирусов) на ген целевого антигена при сохранении неструктурных генов, которые отвечают за синтез белков, обеспечивающих репликацию. Основное преимущество этого подхода по сравнению с использованием нереплицирующихсямРНК заключается в том, что благодаря самовоспроизведению вектора invivo наблюдается высокий уровень экспрессии целевого антигена. Введение таких векторов запускает иммунный ответ, наиболее близкий к таковому в условиях естественной инфекции, — вакцинный вектор начинает реплицироваться в клеткехозяине, образуя двуцепочечныеРНКинтермедиаты, которые являются лигандомТоллподобного рецептора3 (TLR3). Передача сигнала через TLR3 приводит к выработке интерлейкина12, который представляет собой цитокин, вызывающий синтез интерферонов, активирующих ответ Тхелперов 1, а затем и цитотоксическихТ-клеток [7]. Однако к настоящему времени не разработана технология получения таких молекул с большим выходом, поскольку они существенно превосходят по размерам нереплицирующиеся векторы. Помимо прочего, РНКвакцины на основе самовоспроизводящегося репликона также подвержены ферментативному расщеплению при введении в организм, а изза гидрофильной природы и высокой молекулярной массы возникает проблема эффективной системы доставки в цитоплазму клеток [8].Доставка РНК в цитоплазму клетки — необходимое условие синтеза целевого антигена. Эта задача решается путем разработки молекулносителей, которые защищают мРНК от быстрой деградации и доставляют ее в цитоплазму без проявления значительного токсического эффекта. Существуют вирусные и невирусные системы доставки РНК. Несмотря на эффективность вирусных систем в плане доставки нуклеиновых кислот внутрь клетки, их применение может быть ограничено в силу возможности возникновения иммунного ответа на вирусный вектор [9]. Невирусные способы доставки подразумевают ассоциирование мРНК с молекуламипереносчиками, а именно липидами, полимерами и пептидами. Все они показали перспективность в доклинических и некоторых клинических исследованиях [4]. При разработке полимерных носителей молекул РНК первоначально был успешно использован полиэтиленимин, но в настоящее время доступны лишь данные доклинических исследований с его применением. Совсем недавно разработаны липидсодержащие полимеры, названные CARTs (высвобождающие переносчики, изменяющие заряд), которые способны доставлять мРНК напрямую в Тлимфоциты, что делает их весьма перспективными при разработке противоопухолевых препаратов [4]. В настоящее время наиболее часто применяемым способом доставки мРНК являются липидные нано частицы. В экспериментах на лабораторных мышах было показано, что инкапсулированная в липидные наночастицымРНКэффективно транскрибируется invivo при различных способах введения в организм [4].Рисунок 5 - Схематическое изображение принципов генной терапии В то время как вакцины на основе нуклеиновых кислот в целом демонстрируют значительные преимущества перед традиционными вакцинами с точки зрения безопасности, индукции как B, так и Tклеточных ответов, мРНКвакцины обладают преимуществами по сравнению с вакцинами на основе ДНК [11]. Методологическая проблема, связанная с ДНКвакцинами, заключается в обеспечении эффективной доставки в ядро клетки,где происходит транскрипция антигена. Кроме того, ДНКвакцины несут потенциальный риск интеграции в геном хозяина, что может привести к инсерционному мутагенезу. У вакцин на основе мРНК подобные риски отсутствуют, поскольку их воспроизводство происходит в цитоплазме клетки [4]. Относительно короткий период полураспада приводит к временной и более контролируемой экспрессии кодируемого антигена. Кроме того, мРНК может быть получена в бесклеточной среде путем транскрипции invitro (IVT), тем самым удается избежать использования бактериальных клеток, в результате чего устраняются проблемы, связанные с присутствием примесей молекул штаммапродуцента. Это обеспечивает простую очистку и удешевляет производство препарата [7]. Все это делает РНК перспективной платформой для разработки лекарственных препаратов.ЗаключениеРазработка методов генной инженерии и создания рекомбинантных молекул ДНК стимулировали развитие наук о жизни. Благодаря мощным инструментам технологии рекомбинантных ДНК, совершенствование которых активно продолжается последние десятилетия, манипулирование ДНК вошло в обычную практику. Клонирование генов стало относительно простым, что привело к прорыву в понимании патогенеза многих заболеваний, способов их диагностики, профилактики и терапии.Современные методы генной инженерии позволяют получать природные белки в количествах, не лимитированных наличием их природного источника, без использования патогенных микроорганизмов. С помощью химерных молекул получают препараты с заданными свойствами.Большой интерес к созданию препаратов на основе ДНК и РНК, наблюдающийся в последние годы, открывает перспективу разработки не только инновационных лекарственных средств при лечении различных типов патологии, но и методик устранения причин заболеваний, вызванных мутациями генов.Все описанные методологические подходы обладают определенными преимуществами и характеризуются некоторыми ограничениями в применении. Выбор платформы для разработки того или иного лекарственного препарата в большой степени зависит от конкретной задачи, стоящей перед исследователем.Список использованных источниковЧернов Н.Н., Покровский В.С.Основы биохимии. Учебное пособие. – М.: Е-ното, 2019. – 34 с.Комов В.П.Биохимия в 2 частях. Часть 2. – М.: Юрайт, 2020. –316 с.Бессолицына Е.Биохимия метаболизма. Учебное пособие. – М.: Издательские решения, 2016. – 286 с.Уилсон К.Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. - М.: Лаборатория знаний, 2021. – 848 с.Кривенцев Ю.Биохимия доступным языком. – М.: Издательские решения, 2020. – 120 с.О'Дэй Э. Внутренне неупорядоченные белки как мишени для лекарств //В мире науки. 2020. № 1-2. С. 12-13.Деев С.М. "Самонаводящееся" лекарство, или молекулярный наноконструктор для тераностики //Наука из первых рук. 2017. № 4 (75). С. 20-33.Бородин П.Е., Бородин Е.А., Войцеховский В.В. От молекулярной биологии к молекулярной и персонифицированной медицине - медицине XXI века //Амурский медицинский журнал. 2017. № 1 (17). С. 69-73.Солвей Дж. Г.Наглядная медицинская биохимия. Учебное пособие. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020. – 168 с.Дорошенко Н.П., Трошин Л.П., Алзубайди Х.К.И. Биотехнология - наука и отрасль сельского хозяйства //Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016. № 116. С. 1700-1732.Мосин О.В., Игнатов И. Разработка метода получения и выделения фотопреобразующего трансмембранного белка бактериородопсина //Новости материаловедения. Наука и техника. 2015. № 1 (13). С. 8. Злобинов А.В., Петровская Л.Е., Шингарова Л.Н., Долгих Д.А. Разработка метода клеточного дисплея для получения искусственных ФНО-связывающих белков.В сборнике: Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. XXVII зимняя молодежная научная школа. Председатель Организационного комитета д.х.н. Т.В. Овчинникова. 2015. С. 127. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В.и др. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1 генотипа с применением метода оптимизации кодонов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017. № 6. С. 63-72.Иванов А.Д. Инновационные способы получения белков и витаминов с применением биотехнологических методов.В сборнике: Экономика и менеджмент в XXI веке: информационные технологии, биотехнологии, физкультура и спорт. Российский государственный университет физической культуры, спорта, молодежи и туризма. Москва, 2020. С. 24-25.Гарбуз С.А., Забодалова Л.А. Методы получения биологически активных пептидов путем гидролиза молочных белков //Естественные и технические науки. 2018. № 2 (116). С. 79-81.Серкова А.Н., Глазова Н.В., Заинкова Н.В., Бунятян Н.Д. Сорбционно-хроматографическое выделение и очистка биологически активных белков молочной сыворотки //Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2017. № 2-1. С. 46-53.