Хроматографические методы разделения белков

Суспензии дают осесть, через несколько минут кран открывают и наполнение колонки продолжают, следующие порции взвеси подливая постепенно. Заполнение колонки во избежание слишком сильного уплотнения сорбента производят при небольшом давлении (особенно существенно следить за данным при работе с гелем сефадекса).
Давление определяет величина h – разница между уровнем жидкости над сорбентом в колонке (или присоединенном к ней верхнем резервуаре) и положением конца шланга, по которому из колонки вытекает элюат.
Нужно следить за тем, чтобы наполнение колонки равномерным было. Заполнив колонку до необходимой высоты, закрывают нижний кран (зажим) и суспензии дают осесть, не допуская «высыхания» наполнителя в колонке (для данного над верхним слоем сорбента слой растворителя всегда должен находиться).
Нужно следить также за тем, чтобы верхний слой наполнителя гладкую горизонтальную поверхность имел. Для уменьшения взмучивания верхнего слоя при внесении в колонку образца над ним иногда помещают кружок поролона или фильтровальной бумаги. Колонку закрывают пробкой с отводом или со стеклянной трубкой и присоединяют к резервуару, как показано на рис. 1.4, хранящему элюирующий раствор.
Для сохранения постоянной скорости тока жидкости через колонку и поддержания постоянного давления употребляют склянку Мариотта или насосы разных конструкций.[5]
Внесение образца в колонку можно несколькими способами производить. Самый простой из них состоит в следующем: осторожно удаляют жидкость с поверхности наполнителя, оставляя слой в 1–2 мм; осторожно при помощи пипетки вносят образец и, открыв нижний кран, ему дают впитаться; остатки образца над сорбентом смывают небольшой порцией элюента; после этого как он впитается поверхностью наполнителя, новые порции элюирующего раствора добавляют, создавая слой в 5–10 см.
После нанесения образца соединяют колонку с верхним резервуаром, устанавливают нужную скорость протекания элюирующего раствора путем изменения рабочего давления и начинают сбор фракций путем коллектора.
Собирать фракции элюата нужно с момента нанесения образца на колонку. Фракции можно собирать в пробирку по объему (с помощью сифонов), по назначенному количеству капель или через определенные промежутки времени.
Элюирование разделяемых веществ с колонок, как правило, проводят растворами, изменяя ионную силу (концентрацию), pH или оба показателя одновременно. При данном градиент pH и ионной силы может быть непрерывным (плавным) или ступенчатым. При создании ступенчатого градиента употребляют серией буферных растворов, пропускаемых через колонку один за другим последовательно.
При данном виде элюции каждый из элюирующих буферных растворов через колонку пропускают до тех пор, пока концентрация белка в вытекающем из колонки элюате, не снизится почти до исходных фоновых значений, пройдя через максимум.[2]
При непрерывном градиенте элюции изменение ионной силы и (или) pH элюирующего раствора случается постепенно, по нелинейной или линейной зависимости от объема протекающей жидкости. Линейное изменение ионной силы или pH элюирующего раствора происходит тогда, когда данные параметры изменяются пропорционально объему протекающей жидкости. Линейный градиент можно получить с помощью прибора, который состоит из 2-ух соединенных между собой одинаковых сосудов, которые установлены на одном уровне (рис. 1.4, А).
В одном сосуде (1) находится буферный раствор со значением ионной силы (или pH), которое к концу опыта должно быть достигнуто, в другом смесителе (2), из которого раствор непосредственно поступает в колонку, вначале находится равный объем исходного буферного раствора. Часто употребляют «вогнутый» или «выпуклый» градиенты, при которых ионная сила раствора уменьшается или увеличивается соответственно по экспоненциальной зависимости. Форму данных градиентов легко получить с помощью простого устройства, которое изображено на рис. 1.4, Б, В.



Заключение


Имеется много способов разделения смеси биологических молекул и выделения их в чистом виде. Для приобретения больших количеств белков часто используются хроматографические методы: ионообменная хроматография разрешает разделять молекулы по заряду, а гель-проникающая – по молекулярной массе. Для анализа макромолекул также применяются методы электрофореза и изоэлектрофокусировки
В зависимости от способа взаимодействия и распределения элементов смеси между неподвижной фазой и  элюентом сегодня выделяют следующие разновидности хроматографических методов:
Адсорбционная. Основу этого метода составляет отличие сорбируемости разделяемых абсорбентом твердых веществ.
Распределительная. У истоков метода стоит растворимость элементов сложного вещества в элюенте и неподвижной фазе.
Ионообменная. Данный вид исследования основывается на отличии постоянных между неподвижной фазой и монокомпонентами исследуемой смеси.
Эксклюзионная. В основе — различная способность проницаемости в неподвижную фазу молекул компонентов.
Осадочная. Данный метод предполагает разную способность элементов смеси выпадать в осадок на твердой неподвижной фазе.



Литература


Kozhemyako V.B., Rebrikov D.V., Lukyanov S.A.et al. Molecular cloning and characterization of an endo-1,3-β-D-glucanase from the mollusk Spisula sachalinensis Comp. Biochem. Physiol. 2014. B 137. P. 169-178.
Westermeier R. Electrophoresis in Practice. Weinheim-New York: WILEY-VCH, 2019. P.350.
Беккер, Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика. Методы хроматографии и капиллярного электрофореза / Ю. Беккер. – М.: Техносфера, 2019. – 472 c.
Дин, П. Д. Г. Аффинная хроматография / П. Д. Г. Дин, В. С. Джонсон, Ф. А. Мидл. – М.: Мир, 2018. – 278 с.
Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. – М.: МЦНМО, 2018. – 248 с.
Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. – М.: Мир, 2016. – 358 с.
Шаповалова, Е. Н. Хроматографическме методы анализа: Методическое пособие для специального курса / Е. Н. Шаповалова, А. В. Пирогов. – МГУ. 2017. – 203 с.









15