Методы анализа антиоксидантной активности лекарственных препаратов

Для оценки абсолютной восстановительной способности антиоксидантов было использовано модифицированное Кларком (1923) уравнение Нернста, связывающее парциальное давление водорода и восстановительный потенциал в единицах rH:
Eh = 1,23 – RT(pH/F + ln[1/Po]/4F),
где Eh – измеренный окислительно-восстановительный потенциал; F – константа Фарадея; R – универсальная газовая постоянная; T – абсолютная температура. Число 1,23 – разность измеренного потенциала при парциальном давлении кислорода в одну атмосферу и в растворе при том же значении рН. rH определяется как:
rH = –log Po,
где Ро – парциальное давление кислорода.
Величина rH характеризует абсолютный восстановительный потенциал соединения, исключая влияние рН на величину измеренного окислительно-восстановительного потенциала. Сравнивая величины rH до и после обработки антиоксидантом, можно получить представление о восстановительной активности соединения, а заодно и сравнить их (табл. 1).
Таблица 1. Значения величин ΔrH ряда коммерческих антиоксидантов.
Соединение ΔrH +/- Стандартное отклонение Microhydrin® 6,83 0,03 0,04 Total Antioxidant 5,48 0,04 0,05 Vitamin C 4,54 0,03 0,05 Antioxidant Plus 3,02 0,04 0,03 Multi Vitamin 2,06 0,03 0,04 CoQ10 1,45 0,02 0,03 Zinc 0,26 0,03 0,04 Nanohydrate® - 0,55 0,03 0,05
Для измерений окислительно-восстановительного потенциала и рН в сосуд с магнитной мешалкой помещали 250 мл бидистиллированной воды и замеряли рН на приборе «Hanna HI 9023», (Hanna Instruments, США) и ред–окс потенциал на приборе «Orion quiсkchek Model 108» (Beverly, США). 100 мг антиоксиданта помещали в 250 мл бидистиллированной воды, перемешивали в течение 2-х минут и снова измеряли рН и редокс-потенциал, разность потенциалов и дает величину ΔrH.
Однако измерение восстановительного потенциала хорошо только in vitro, проблема моделирования in vivo при этом сохраняется. В самом деле, если сделать предположение о том, что наилучшими антиоксидантами являются энергичные восстановители, то можно дойти до абсурдного вывода об эффективности таких соединений, как борогидрид натрия NaBH4 или алюмогидрид лития LiAlH4, которые в физиологических условиях окажутся, скорее всего, сильнейшими цитотоксикантами. Поэтому наряду с величиной абсолютного восстановительного потенциала исследователи оценили и эффективность антиоксидантов на живой модели.
В качестве таковой подходят яйцеклетки китайского хомяка (СНО), а в качестве удобных для контроля реакционноспособных кислородных частиц – поглощающие излучение радикалы красителя малахитового зеленого. Генерирование свободных радикалов из молекул красителя осуществляется при облучении прокрашенных им клеток при помощи гелий-неонового лазера при длине волны 632,8 нм в течение 1 ч и мощности 2000 Вт/м2. Это и есть процесс фотосенсибилизации клеток. По ее завершении аликвоты по 500 мкл взвеси клеток с содержание 6×104 клеток/мл переносили в две 1 мл кюветы, в одну из которых добавляли 500 мкл бидистиллированной воды, а в другую – 500 мкл раствора антиоксиданта концентрацией 400 мкл/мл.
Кюветы стояли в течение 15 мин, после чего определяли поглощение в каждой из них на длине волны 629 нм.
Процент восстановления свободных радикалов определяли по формуле:
% Reduced = 100%{(A(629)sam – A(629)min)/(A(629)max – A(629)min)}.
Затем каждый образец клеток окрашивался в течение 30 мин смесью «живой/мертвый» («LIVE/DEAD®», L-3224, Molecular Probes, США), состоящей из 1 мл 2 мкМ кальцеина-АМ и 4 мкМ этидиум гомодимера-1 (EthD-1), и анализировали методом флуоресцентной микроскопии. Результаты исследований с фотосенсибилизацией клеток приведены в таблице 2.
Таблица 2. Восстановление свободных радикалов в клетках.
Соединение % Reduced +/– Стандартное отклонение Microhydrin® 91,6 0,39 0,04 Total Antioxidant 77,7 0,22 0,05 Vitamin C 71,0 0,40 0,05 Antioxidant Plus 67,0 0,56 0,03 Multi Vitamin 52,3 0,58 0,04 CoQ10 25,1 0,42 0,03 Zinc 15,9 0,46 0,04 Nanohydrate® 1,8 0,36 0,05
Многие из антиокислителей оказались способными связывать свободные радикалы, сохраняя при этом жизнеспособность клеток. Оценка жизнеспособности основана на том, что кальцеин АМ, взаимодействуя с внутриклеточной эстеразной активностью в живой клетке, образует флуоресцирующие при 530 нм (зеленый цвет) продукты. Если клетка утратила жизнеспособность, интенсивность флуоресценции резко снижается, при этом проникающий через клеточную мембрану EthD-1 взаимодействует с ДНК, генерируя интенсивную красную флуоресценцию.
Достоинства и слабые места использования окисления протеинов в качестве маркера окислительного стресса in vivo обсуждаются авторами [5]. Утверждается, что протеины имеют преимущество по сравнению с такими маркерами, как продукты перекисного окисления или ДНК, потому, что всякая модификация протеинов весьма сильно отражается на их биологических свойствах. К тому же продукты модификации (окисления) протеинов относительно стабильны и легко детектируемы. Вид их модификации позволяет более точно определить повреждающие механизмы и факторы.
Окислительное повреждение ДНК радикалами, образующимися в реакции Фентона, с последующим анализом продуктов окисления использовано для оценки хемопротекторной и антиокислительной активности соединений. 250 мкг ДНК инкубируется в присутствии (500–600 мкМ) или без антиоксидантов в растворе диметилсульфоксида (<5%) в трис-буфере при 37 °С в течение 15 мин.
Затем добавляются реагенты Фентона (25 мкМ CuSO4; 0,1–3 мM H2O2; 100 мкM NTA; 100 мкM аскорбиновой кислоты), продуцирующие гидроксил-радикалы и смесь инкубируется еще 45 мин при той же температуре. После инкубации ДНК осаждается этанолом с хлористым натрием. ДНК, содержащая образованные 8-оксопроизводные гуанозина, анализируется после маркирования радиоактивным 32Р.
Антиокислительная активность кверцетина в лизосомальных фракциях печени мыши изучалась с использованием гидрофильного генератора радикалов 2,2′-азо-бис-(2-амидинопропан)-дигидрохлорида (ААРН) и гидрофобного генератора радикалов 2,2′-азо-бис-(2,4-диметилвалеронитрила) (AMVN). Ингибируемое кверцетином лизосомальное пероксиокисление липидов измерялось по методу TBARS с реакционными частицами тиобарбитуровой кислоты. Отмечается, что антиокислительная активность кверцетина на модели с гидрофильным генерированием радикалов оказалась выше.
Синтетический жирорастворимый антиоксидант ди-трет-бутил-п-крезол оказался более активен в реакциях окисления липидов, нежели кверцетин и тем более, чем рутин – гликозид кверцетина. Изучение ингибирующего влияния антиокислительной активности всех рацематов альфа-токоферола, 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола (ВНТ) и Тролокса на образование реакционных частиц тиобарбитуровой кислоты (TBARS) и короткоцепочечных альдегидов в гомогенатах печени крыс исследовалось следующим образом.
Концентрации TBARS измеряли флуориметрически, а альдегиды определялись методом газовой хроматографии после дериватизации пробы метилгидразином. Показано, что содержание TBARS и альдегидов в гомогенатах печени в процессе пробоподготовки снижается в присутствии антиоксидантов.
Предполагается, что эти вещества образуются в результате автоокисления гомогенатов в процессе подготовки пробы. Наиболее эффективным ингибитором образования альдегидов оказался токоферол, а накопление TBARS в максимальной степени подавляется Тролоксом.



Заключение
В заключение хочется отметить объективную невозможность существования не то что единого метода для оценки антиокислительной активности соединений, но даже возможности сравнения результатов, полученных разными методами. И связано это, очевидно, с многообразием протекающих в природе радикальных процессов.
Одно дело, когда определяется антиокислительная активность соединения (или группы соединений), применяемого для стабилизации химических продуктов и полимеров, и совсем другое – влияние антиоксидантов на процессы, протекающие в живой клетке. В результате каждый исследователь выбирает готовый, создает новый или модифицирует уже известный метод, исходя из своих целей и возможностей.


Список литературы
Оковитый С.В. Клиническая фармакология антиоксидантов. Клиническая фармакология. Избранные лекции. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 602 с.
Shea T.B., Rogers E., Ashline D., Ortiz D., Sheu M.-S. Quantification of antioxidant activity in brain tissue homogenates using the ‘total equivalent antioxidant capacity’. // Journal of Neuroscience Methods. 2003. V. 125. P. 55-58.
Магин Д.В., Измайлов Д.Ю., Попов И.Н., Левин Г., Владимиров Ю.А. Фотохемилюминесценция как метод изучения антиоксидантной активности в биологических системах. Математическое моделирование. // Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 4. С. 65-68.
Короткова Е.И. Новый способ определения активности антиоксидантов // Журнал физической химии. 2000. Т. 74. №9. C. 1544-1546.
Shenkin A. The key role of micronutrients. // Clin. Nutr. 2006. V. 25. № 1. Р. 1-13.
Shacter E. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples. // Drug Metabolism Reviews. 2000. V. 32. №3-4. P. 307-326.









22